New polymorphism in the sodium channel gene of Rhipicephalus microplus tick (Ixodida: Ixodidae) resistant to pyrethroids

Rhipicephalus microplus, garrapata común de los bovinos, transmite patógenos que afectan la producción ganadera en áreas tropicales. Para su control se han utilizado compuestos piretroides cuyo uso inapropiado ha generado resistencia en esta especie de garrapata. El estudio de los mecanismos de resi...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autores principales:	RIVERA, EDGAR DIAZ, Holguin Cespedes, Gisella, Urrea Montes, Daniel A.
Formato:	Online
Idioma:	eng
Publicado:	Universidad de Costa Rica 2019
Acceso en línea:	https://revistas.ucr.ac.cr/index.php/rbt/article/view/35250

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description	Rhipicephalus microplus, garrapata común de los bovinos, transmite patógenos que afectan la producción ganadera en áreas tropicales. Para su control se han utilizado compuestos piretroides cuyo uso inapropiado ha generado resistencia en esta especie de garrapata. El estudio de los mecanismos de resistencia hacia piretroides en R. microplus, ha demostrado la presencia de mutaciones en genes relacionados con su acción, ya sea de enzimas que inactivan el compuesto o de los canales del sodio, sitio blanco del acaricida. En Colombia, la primera fase del presente proyecto encontró una mutación en una esterasa hidrolizante en poblaciones de campo de R. microplus resistentes a piretroides. Como se ha demostrado que la resistencia a químicos en esta garrapata es multigénica, en su segunda fase el proyecto tuvo como objetivo principal detectar un polimorfismo en la posición 2134 del gen del canal del sodio. Esta mutación sustituye una timina por una adenina, T2134A, y ha sido relacionada previamente en otros países con resistencia a piretroides en los individuos portadores. Para ello se colectaron 182 garrapatas R. microplus en dos fincas con historial de resistencia a este tipo de acaricidas y se sometieron a una prueba de inmersión de hembras en una solución de cipermetrina preparada a la dosis recomendada por uso en campo, obteniendo seis individuos susceptibles, 92 resistentes y 84 medianamente resistentes. Se extrajo el ADN de todos los especímenes mediante el método fenol–cloroformo y se proceso por PCR convencional empleando cebadores alelo específicos para amplificar un segmento del dominio IIIS6 del gen del canal del sodio. Los amplicones resultantes se detectaron por electroforesis en geles de agarosa al 2% teñidos con GelRed® y se visualizaron con luz ultravioleta. De igual manera se efectuó el secuenciamiento de 20 muestras obtenidas en los tres fenotipos susceptible, medianamente resistente y resistente y las secuencias resultantes fueron alineadas mediante el programa Mega 7 y comparadas con secuencias almacenadas en el GenBank®. Los análisis mostraron que la población de R. microplus estudiada no presentaba la mutación esperada sino una mutación diferente en el sitio 2134. En el ADN de garrapatas resistentes y medianamente resistentes se observó la sustitución de una timina por una citosina, T2134C, que a la traducción genera el cambio de una fenilalanina por una leucina, a diferencia de la mutación previamente identificada, que genera el cambio de una fenilalanina por una isoleucina. Esto demuestra la presencia de un polimorfismo que no ha sido reportado en otros estudios con esta especie de garrapata y que generaría un nuevo marcador molecular de resistencia a piretroides para poblaciones de este acaro. Palabras clave: garrapatas; resistencia a químicos; pesticidas; mutaciones; reacción en cadena de la polimerasa.
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As it has been demonstrated that the resistance to chemicals in this tick is multigenic, in its second phase the project has as main objective to detect a polymorphism at position 2134 of the sodium channel gene. This mutation sustitutes a thymine for an adenine, T2134A, and has been previously related in other countries with pyrethroids resistance in carriers. For this, 182 R. microplus ticks were collected in two farms with history of resistance to this type of acaricides and they were subjected to the engorged female tick immersion test in a cypermethrin solution prepared at the recommended dose for field use obtaining six susceptible individuals, 92 resistant and 84 moderately resistant. DNA was extracted from all specimens by the phenol-chloroform method and was processed by conventional PCR using specific allele primers to amplify a segment of the IIIS6 domain of the sodium channel gene. The resulting amplicons were detected by electrophoresis in 2% agarose gels stained with GelRed® and visualized with ultraviolet light. In the same way, the sequencing of 20 samples obteined from the three susceptible, moderately resistant and resistant phenotypes was carried out and the resulting sequences were aligned through the Mega 7 program and compared with sequences stored in the GenBank®. Analyzes showed that the population of R. microplus studied did not present the expected mutation but a different mutation at site 2134. In the DNA of resistant and moderately resistant ticks, it was observed the substitution of a thymine for a cytosine, T2134C, that to the translation generates the change from a phenylalanine to a leucine, unlike the mutation previously reported that generates the change of a phenylalanine for a isoleucine. This shows the presence of a novel polymorphism that has not been reported in other studies with this tick species and that would generate a new molecular marker of pyrethroid resistance for populations of this mite.Key Words: ticks; chemical resistance; pesticides; mutations; polymerase chain reaction Rhipicephalus microplus, garrapata común de los bovinos, transmite patógenos que afectan la producción ganadera en áreas tropicales. Para su control se han utilizado compuestos piretroides cuyo uso inapropiado ha generado resistencia en esta especie de garrapata. El estudio de los mecanismos de resistencia hacia piretroides en R. microplus, ha demostrado la presencia de mutaciones en genes relacionados con su acción, ya sea de enzimas que inactivan el compuesto o de los canales del sodio, sitio blanco del acaricida. En Colombia, la primera fase del presente proyecto encontró una mutación en una esterasa hidrolizante en poblaciones de campo de R. microplus resistentes a piretroides. Como se ha demostrado que la resistencia a químicos en esta garrapata es multigénica, en su segunda fase el proyecto tuvo como objetivo principal detectar un polimorfismo en la posición 2134 del gen del canal del sodio. Esta mutación sustituye una timina por una adenina, T2134A, y ha sido relacionada previamente en otros países con resistencia a piretroides en los individuos portadores. Para ello se colectaron 182 garrapatas R. microplus en dos fincas con historial de resistencia a este tipo de acaricidas y se sometieron a una prueba de inmersión de hembras en una solución de cipermetrina preparada a la dosis recomendada por uso en campo, obteniendo seis individuos susceptibles, 92 resistentes y 84 medianamente resistentes. Se extrajo el ADN de todos los especímenes mediante el método fenol–cloroformo y se proceso por PCR convencional empleando cebadores alelo específicos para amplificar un segmento del dominio IIIS6 del gen del canal del sodio. Los amplicones resultantes se detectaron por electroforesis en geles de agarosa al 2% teñidos con GelRed® y se visualizaron con luz ultravioleta. De igual manera se efectuó el secuenciamiento de 20 muestras obtenidas en los tres fenotipos susceptible, medianamente resistente y resistente y las secuencias resultantes fueron alineadas mediante el programa Mega 7 y comparadas con secuencias almacenadas en el GenBank®. Los análisis mostraron que la población de R. microplus estudiada no presentaba la mutación esperada sino una mutación diferente en el sitio 2134. En el ADN de garrapatas resistentes y medianamente resistentes se observó la sustitución de una timina por una citosina, T2134C, que a la traducción genera el cambio de una fenilalanina por una leucina, a diferencia de la mutación previamente identificada, que genera el cambio de una fenilalanina por una isoleucina. Esto demuestra la presencia de un polimorfismo que no ha sido reportado en otros estudios con esta especie de garrapata y que generaría un nuevo marcador molecular de resistencia a piretroides para poblaciones de este acaro. Palabras clave: garrapatas; resistencia a químicos; pesticidas; mutaciones; reacción en cadena de la polimerasa. Universidad de Costa Rica 2019-09-01 info:eu-repo/semantics/article info:eu-repo/semantics/publishedVersion Article application/pdf text/html https://revistas.ucr.ac.cr/index.php/rbt/article/view/35250 10.15517/rbt.v67i4.35250 Revista de Biología Tropical; Vol. 67 No. 4 (2019): Volume 67 – Regular number 4 – September 2019; 935–944 Revista de Biología Tropical; Vol. 67 Núm. 4 (2019): Volumen 67 – Número regular 4 – Setiembre 2019; 935–944 Revista Biología Tropical; Vol. 67 N.º 4 (2019): Volume 67 – Regular number 4 – September 2019; 935–944 2215-2075 0034-7744 10.15517/rbt.v67i4 eng https://revistas.ucr.ac.cr/index.php/rbt/article/view/35250/39658 https://revistas.ucr.ac.cr/index.php/rbt/article/view/35250/39659 Copyright (c) 2019 EDGAR DIAZ RIVERA, Gisella Holguin Cespedes, Daniel A. Urrea Montes http://creativecommons.org/licenses/by/4.0

New polymorphism in the sodium channel gene of Rhipicephalus microplus tick (Ixodida: Ixodidae) resistant to pyrethroids

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